Helicoverpa armıgera'dan izole edilen serratıa marcescens bakterisine ait kitinaz A, B ve C genlerinin klonlanması, karakterizasyonu, ekspresyonu ve enzim aktivitelerinin belirlenmesi

Abstract

Fungal hücre duvarı ve böcek dış iskeleti temel yapı bileşeni olarak kitin içerdiğinden kitinaz enzimleri hem çeşitli bitki hastalıklarına neden olan fitopatojen funguslara hem de zararlı böceklere karşı biyolojik kontrol ajanı olarak kullanılma potansiyeline sahiptirler.Bu çalışmada, doğal olarak ölmüş Helicoverpa armigera larvasından Serratia marcescens bakterisi izole edildi. Bu bakteriden kitinaz A, B ve C enzimlerini kodlayan genler ( chiA, chiB ve chiC) dejenerat primerler kullanılarak PCR ile çoğaltıldı. Çoğaltılan genlerin nükleotid dizilimini belirlemek için PCR ürünleri pGEM-T Easy klonlama vektörüne klonlandı ve dizin analizine gönderildi. Dizin analizi yapılan kitinaz A, B ve C genlerinin DNA ve aminoasit sıraları literatürdeki mevcut kitinaz genlerinin DNA ve aminoasit sıraları ile karşılaştırıldı.Analiz sonuçları bu çalışmada izole edilmiş S. marcescens bakterisine ait kitinaz A geninin literatürde ki S.marcescens (BJL200) chiA genine %99, kitinaz B'nin literatürde ki S.marcescens (BJL200) chiB genine %97 ve kitinaz C'nin ise literatürde ki S. marcescens chiC1 genine %96 oranında benzer olduğunu gösterdi. Dizin analizi yapılan bu kitinaz genleri pET-28a(+) ekspresyon vektörüne klonlanarak Escherichia coli'de proteinleri ekspres edildi. Ekspres edilen proteinler saflaştırılarak, SDS-PAGE analizine tabi tutuldular. Bu analiz sonucunda kitinaz A genine ait 57kDa'luk, kitinaz B genine ait 53kDa'luk ve kitinaz C genine ait 50kDa'luk protein bantları jel üzerinde belirlendi.Elde edilen enzimlerin en iyi çalıştığı pH ve sıcaklık aralıklarına bakıldı. Buna göre; kitinaz B'nin en iyi pH 9 ve 35oC sıcaklıkta, kitinaz C'nin ise pH 8,5 ve 33 oC sıcaklıkta aktivite gösterdiği belirlendi.