Anopheles gambiae ve Apis mellifera globinlerinin klonlanması ve ön karakterizasyonu

Abstract

Yakın zamana kadar böceklerin sahip olduğu trake solunum sisteminin yüksek difüzyon ve kapasite katsayısının yeryüzündeki en büyük böcek için bile yeterli olacağı ve bu sebeple solunum proteinlerinin böcekler için gereksiz olduğu düşünülmekteydi. Sadece Chironomus gibi oksijence fakir ortamda yaşayan birkaç tür istisna olarak biliniyordu. Fakat son yıllarda globinlerin böceklerde daha yaygın bir şekilde bulunduğu Drosophila, Anopheles, Apis gibi hayat döngüleri boyunca oksijence fakir ortamda yaşamayan türlerde de globin varlığının ortaya konmasıyla kanıtlandı. Bu çalışmada, A. gambiae ve A. mellifera cDNA'sı (Johannes Gutenberg Univesität Mainz, Prof. Thomas Hankeln'den alındı) pET sistemi kullanılarak klonlanıp ekspres edildi. Yanı sıra, sistein kalıntısının serin ile yer değiştirildiği ?Cys mutantı da klonlanıp ekspres edildi. Ekspres edilen proteinler saflaştırılıp spektroskopik analiz, kuaterner yapı belirlemesi gibi ön yapı karakterizasyon analizleri yapıldı. Kinetik çalışmalar AgaGb ve AmeGb globinlerinin ?Cys mutantlarına uygulanarak karbonmonoksit bağlama özellikleri ölçüldü. Elde edilen sonuçlara göre, bu iki böcek globinin deoksi formunda altı konformasyona sahip olduğu tahmin edildi. AgaGb çözeltide dimer, AmeGb'nin ise monomer ve dimer yapısının denge halinde bulunduğu gözlendi. Kinetik çalışmalar da ise, AmeGb'nin karbonmonoksit ligantı bağlama hız sabitinin AgaGb'in yaklaşık 10 katı olduğu tesbit edildi ve AmeGb'in aktif bölge kavitesinin harici ligandı hapsetmeye AgaGb'in kıyasla daha elverişli olduğu gözlendi. Until recently, respiratory proteins have been considered unnecessary in most insects because their tracheal systems were thought to be sufficient for the biggest insect O2 supply due to high diffusion rates and capacity coefficients. Only a few species that survive under hypoxic conditions were known exceptions such as Chironomidae. However, in recent years it has become evident that globins are found much more widespread in insects, with identification of globin existence in species that do not live in oxygen deficient environments such as Drosophila, Anopheles, Apis. In this study, cDNA of Anopheles gambiae and Apis mellifera (obtain from Prof. Thomas Hankeln from Johannes Gutenberg Univesität Mainz), were cloned and expressed with the pET system. Also a mutant was made where the cysteine residues were substituted for serine (?Cys mutant). The produced proteins were purified and preliminary characterization, such as spectroscopic analysis and determination of quaternary structure was made. Kinetic measurements were applied to the ?Cys mutant of AgaGb and AmeGb to measure carbon monoxide binding properities. Due to the results that we gained in this study, we estimated that these two insects globins are hexa coordinated in the deoxy form. AgaGb is thought to occur as a dimer in solution, while the AmeGb is in equilibrium between the monomeric and tetrameric structure. Kinetic measurements show that rate constant of carbon monoxoside of AmeGb is nearly 10 times bigger than of AgaGb, and active site cavity of AmeGb is more appropriate to trap the external ligand than of AgaGb.