Termofilik Geobacillus caldoxylosilyticus TK4'ten elde edilen rekombinant glukoz izomerazın bazı özelliklerinin mutasyonla geliştirilmesi

Abstract

Bölge spesifik mutasyonlar yapılarak daha yüksek sıcaklık ve düşük pH değerlerinde çalışabilen, glukoza karşı daha ilgili ve daha yüksek pH ve ısıl kararlılığa sahip glukoz izomerazın elde edilmesi amaçlanan bu çalışmada pET-28a(+) vektörüne önceden klonlanmış Geobacillus caldoxylosilyticus TK4GI geni üzerinde bölge özgün mutasyonları olan H99Q, V184T, D102N ve H99Q/D102N mutasyonları yapılmış, elde edilen mutant genler BL21(DE3)pLysE konakçı hücresine aktarılıp ekspres edilerek mutant proteinler nikel afinite kromatografisi ile saflaştırılmış ve her bir enzimin biyokimyasal karakterizasyonu yapılmıştır. Yapılan mutasyon çalışmaları sonucunda enzimin optimum sıcaklık ve Km değerinde artma, optimum pH ve Vmax değerinde ise azalma görülmüştür. Rekombinant enzimle karşılaştırıldığında özellikle pH 6,0'daki pH kararlılığında artma meydana gelmiştir. Literatürdeki ısıl kararlılık çalışmalarıyla kıyaslandığında, özellikle depolama sıcaklığı olan 4 °C'de bir miktar artış gözlenmiştir. Ayrıca en yüksek enzim aktivitelerinin genel olarak Co2+, Cu2+ ve Mn2+ varlığında olduğu gözlenmiş ve bazı metal iyonlarının inhibisyonuna karşı daha dirençli hale gelmiştir. Elde edilen veriler değerlendirildiğinde, yapılan mutasyonlarla enzimin optimum pH, optimum sıcaklık, pH kararlılığı ve depolama şartlarındaki ısıl kararlılığında istenilen yönde iyileşmeler elde edilirken, enzimin substratına duyduğu ilginin ve maksimum enzim aktivitesinin kısmen azaldığı belirlenmiştir. Bu çalışma TÜBİTAK (109T985) tarafından desleklenmiştir. In this study, it was aimed to obtain a glucose isomerase which 1) work at higher temperature and 2) lower pH value, 3) has more affinity to glucose, more 4) pH and 5) thermal stable by performing four site-directed mutations. H99Q, V184T, D102N ve H99Q/D102N mutations were performed for Geobacillus caldoxylosilyticus TK4GI gene that was previously cloned to pET-28a(+) vector. The obtained mutant genes were overexpressed in a BL21(DE3)pLysE host cell. Mutant proteins were purified by nickel affinity chromatography. Biochemical characterization of all mutant enzymes was examined. The findings are that the mutations mentioned above induced 1) an increase in optimum temperatures and 3) Km values of mutant proteins but 2) a decrease at optimum pHs and Vmax values, 4) an increase in the pH stability at pH 6.0 compared to recombinant enzyme, 5) to be more stable in temperatures especially at 4 °C compared to literature. Also in general, the highest activities of mutant enzymes were observed in the presence of Co2+, Cu2+ and Mn2+ and mutant enzymes were more resistant to inhibition of some metal ions.In conclusion, optimum pH, optimum temperature, pH stability and stability at storage temperature value of recombinant enyzme was improved as aimed, but affinity to substrat and maximum enzyme activitiy slightly decreased. This study was supported by the grant from TUBITAK (109T985).