On-line HPLC-karbonik anhidraz enzim tayin yöntemi geliştirilmesi ve protein karışımlarında uygulanması

Abstract

Aktif proteinlerin karmaşık numunelerden saflaştırılıp ayrılması işlemi oldukça zahmetli ve zaman alan bir süreci içermektedir. Giderek yaygınlaşan on-line HPLC uygulamaları, doğal biyoaktif bileşenlerin tespiti için önemli avantajlar sunmaktadır. Bu çalışmada protein karışımlarında esteraz aktivitesi gösteren proteinlerin on-line olarak belirlenip eş zamanlı karbonik anhidraz enzim tayininin yapılabildiği on-line HPLC-CA enzim tayin yöntemi geliştirilmiştir. Geliştirilen yöntem, akış hızları, tampon çözelti seçimi, konsantrasyonu ve pH' sı, reaksiyon sıcaklığı, tübing boyu ve substrat konsantrasyonu parametreleri üzerinden optimize edilmiştir. pH' sı 8,2 olan 0,15 M fosfat tamponu 0,5 mL/dk akış hızı ile, 5 mM p-nitrofenil asetat 0,3 mL/dk akış hızı ile sisteme gönderilip 210 nm' de protein ayrımı, 400 nm' de esteraz aktivitesi tespitinin 25 °C sıcaklıkta ve 3 m tübing boyunda yapılmasıyla optimum çalışma şartlarına ulaşılmıştır. Optimize edilmiş on-line HPLC-CA enzim tayin yöntemi, doğrusallık, doğrusal aralık, tespit (LOD) sınırı, tayin (LOQ) sınırı, kesinlik ve sağlamlık parametreleri üzerinden valide edilmiştir. Yöntemin, 5 mg/mL BCA seviyelerine kadar doğrusal seyrettiği, LOD' un 0,03 mg/mL ve LOQ' un 0,07 mg/mL olduğu tespit edilmiştir. Tekrarlanabilirlik ve ara kesinlik bakımından %1 altındaki bağıl standart sapma yöntemin kesinliğini, akış hızı, reaksiyon sıcaklığı, hareketli fazın pH' sı ve konsantrasyonunda yapılan küçük değişiklikler sonucunda %5 altındaki bağıl hata ise yöntemin sağlamlığını göstermiştir. Yapılan çalışmalar, geliştirilen yöntemin protein içeriği bilinen ve bilinmeyen tüm çözeltilere rahatlıkla uygulanabileceğini ortaya koymuştur.