Yeni bir on-line HPLC-CA inhibitör belirleme yönteminin geliştirilmesi ve biyoaktif bitki ekstraktlarına uygulanması

Abstract

Karbonik anhidraz (CA) inhibitörleri (CAI) çeşitli tedavilerde kullanılmaktadır. Doğal CAI araştırmaları giderek artan oranda ilgi görmektedir. Doğal biyoaktif bileşenlerin tespitinde on-line HPLC uygulamaları önemli avantajlar sunmaktadır. Ayrılan bileşenlerin aktivitelerinin belirlenmesinde antioksidan ve enzim inhibisyon araştırılması en fazla karşılaşılan çalışmalardır. Bu çalışmada 17 bitkiden üç çözücüyle hazırlanan 51 ekstraktın CAI aktiviteleri belirlenmiş ve yeni on-line (kombine) HPLC-DAD-CAI yöntemi geliştirilmiştir. Klasik ve HPLC yöntemlerinde kullanılabilen beş çözücünün (metanol, etanol, aseton, asetonitril, DMSO) CA aktivitesi üzerine etkisi araştırılmıştır. Öncelikle sığır CA'sı (BCA), insan hCA-I ve hCA-II izoenzimleri afinite kromatografisiyle eritrositlerden saflaştırılmış, diyaliz ve liyofilizasyon sonrası SDS-PAGE kullanılarak saflık kontrolü yapılmıştır. Beş çözücünün CA enzimlerinin esteraz ve hidrataz aktivitelerini azalttığı gözlemlenmiştir. %10-15 çözücü konsantrasyonlarına kadar aktivitenin değerlendirilebileceği tespit edilmiştir. Bitki ekstraktlarının CA enzimlerinin esteraz ve hidrataz aktivitelerini baskıladığı belirlenmiştir. Ayrıca bu ekstraktların toplam fenolik madde miktarları da belirlenmiştir. Bu iki ölçüm arasında korelasyon olduğu görülmüştür. Hidrataz ve esteraz aktivite inhibisyon verilerinde de ileri derecede uyum görülmüştür. Çözücünün inhibitör bileşiklerin etkilerinde yapabileceği değişiklik de araştırılmıştır. On-line HPLC sisteminde etkili olabilecek sıcaklık, pH, tampon konsantrasyonu spektrofotometrik yöntemle esteraz aktivitesi için araştırılmış ve uygun şartlar belirlenmiştir. Standart inhibitörler sülfanilamid ve asetazolamid kullanılarak on-line HPLC-DAD-CAI yöntemi geliştirilmiş, yöntemle konsantrasyonu bilinen bileşiğin tek konsantrasyonda uygulamayla IC50 değerinin nasıl belirlenebileceği gösterilmiştir. Daha önce geliştirilmiş olan on-line HPLC-FRAP antioksidan yöntemi CAI yöntemiyle birlikte kullanılarak kombine HPLC-DAD-FRAP-Spektrofotometrik CAI yöntemi uygulaması yapılmış, yöntemin getirdiği avantajlar ortaya konmuştur. Seçilen bitki ekstraktları geliştirilen yöntemle değerlendirilmiştir. Geliştirilen yöntemin yüksek aktiviteye sahip, IC50 değeri 50 μM'ın altında olan klinik değeri yüksek bileşiklerin tespitinde kullanılabileceği ortaya konmuştur.