Thermus Scotoductus K6' Dan İzole Edilen Yeni, Kriptik, Küçük, Çok Kopyali Bir Plazmitin (pHIG22) Fonksiyonel Analizi

Abstract

Bu çalışmada, Thermus scotoductus K6 bakterisinden izole edilen ve tanımlanan, 2222 bp uzunluğunda,yeni, kriptik, küçük, çok kopyalı, çift zincir, % 62,78 GC içerikli yeni bir plazmit (pHIG22) karakterize edildi ve fonksiyonel analizi yapıldı. pHIG22 plazmitinin 387. bazı ile 614. bazı arasında kalan 2012 bp'lik bölgenin replikasyondan sorumlu minimal replikonu olduğu belirlendi. TEM analizleri ile plazmitin "Teta" tip replikasyon moduna sahip olduğu, replikasyon orijininin 46. baz ile 239. baz (BamHI kesim bölgesi '0' noktası kabul edildiğinde ve ters oryantasyonda) arasındaki bölge olduğu tespit edildi. pHIG22'nin her iki zincirinden transkript kodlandığı belirlendi. RACE ve LACE analizleri sonucunda, Transkript 1'in 1622 bp büyüklükte (329-1950), Transkript 2'ninde 1712 bp büyüklükte (2103-329) olduğu tespit edildi. Transkriptlerin proteine dönüşüp dönüşmediğinin belirlenmesi için yapılan çalışmalarda; SDS-PAGE, Zimogram, 2D jel analizi ve MALDI-TOF/TOF analizleri sonucunda transkriptlerin herhangi bir protein kodlamadığı sonucuna varıldı. Transkriptlerin düzenleyici bölgeleri incelenerek, her iki zincirde promotör diziler olduğu belirlendi. E.coli suşlarında replike olmadığı belirlenen pHIG22'nin T. scotoductus K6 bakterisindeki kopya sayısı Real-time qPCR tekniği ile 148 olarak hesaplandı. pHIG22 minimal replikonu ve farklı DNA parçaları kullanılarak, E.coli-Thermus suşlarında replike olabilen pUCHIGK shuttle klonlama vektörü ve pHIGKE2 shuttle ekspresyon vektörü dizayn edildi.