Acidithiobacillus ferrooxidans M1 yaban tip ve mutant (Q9F ve S21Y/V22D) demir oksidazlarının biyokimyasal karakterizasyonu

Abstract

Bu çalışmada, Espiye, Murgul ve Gümüşhane'de bulunan asidik su kaynaklarından su örnekleri alındı. Bu su örneklerinde asidofilik bakterilerin varlığı incelendi. Bu bölgelerden elde edilen 12 farklı izolatın 16S rRNA genlerine göre tür düzeyinde tanımlanması yapıldı. Buna göre izolatlardan beşinin Acidithiobacillus, üçünün Acidiphilium ve dördünün de Acidocella cinsine ait olduğu belirlendi. Murgul bakır madeninden izole edilen Acidithiobacillus ferrooxidans M1 suşunun demir oksidaz proteinini kodlayan iro geni klonlanarak izole edildi ve baz dizilimi belirlendi. İzole edilen gen, pET-28a(+) ekspresyon vektörüne klonlanarak E. coli BL21(DE3) suşu içerisinde yüksek miktarlarda üretildi. Demir oksidaz proteinine ait korunmuş bölgeler incelenerek, bölge özgün mutasyon yöntemiyle, klonlanan demir oksidaz üzerinde Q9F ve S21Y/V22D mutasyonları yapıldı. Yaban tip ve mutant enzimler saflaştırıldı ve karakterize edildi. Mutant enzimler yaban tip enzim ile biyokimyasal özellikleri ve kinetik parametreleri bakımından karşılaştırıldı. Yaban tip enzimin optimum pH'sı 4,0, optimum sıcaklığı 25°C, Km'si 0,27 ± 0,09 mM ve Vmax'ı ise 0,083 ± 0,01 μmol/dk/mg protein olarak belirlendi. Yapılan mutasyonlar enzimin kinetik parametrelerinde önemli bir değişiklik meydana getirmezken, her iki mutantın optimum pH'sı da 3,5 olarak belirlendi. Ayrıca S21Y/V22D mutantında pH kararlılığının arttığı görüldü.