Aeribacillus pallidus AC6'da yüksek seviyede ekspres edilen flagellin geninin (hag) klonlanması, promotor yapısı, flagellar spesifik transkripsiyon faktörünün (sigma-d) izolasyonu ve saflaştırılması

Abstract

Bu çalışmada Aydın ili Çamköy köyü Çamur kaplıca suyundan izole edilen termofilik bir bakteri olan Aeribacillus pallidus AC6 bakterisi kullanıldı. AC6 hücresinde yüksek seviyede ekspres edilen bir protein belirlendi ve MALTI-TOF analizleri sonucunda bu proteinin flagellin protein olduğu belirlendi. Bu protein sekanslarından yola çıkılarak AC6 flagellin (hag) genin birkısmı çoğaltıldı. Genin geri kalan kısmı invers-PCR yöntemi ile tamamlandı.5'-RACE tekniği ile flagellin geninin transkripsiyon başlama bölgesinin translasyon başlama kodonundan 79 ve 80 bp upstream bölgede yer alan G ve T bazları olduğunu gösterildi. Transkripsiyon başlama kodunu belirlendikten sonra incelenen upstream bölgede ?D faktör tarafından tanınan promotor bölge sekanslarının varlığı gözlemlendi. Yapılan ß-galaktosidaz deneyi sonucunda, AC6 hag geninin -35 bölgede TAAA sekanslarına, -10 bölgede CCGATAT sekanslarına sahip olduğu ve bu sekansların bakteriyel RNAP enziminin ?D faktörü tarafından tanındığı tespit edildi.AC6 hag promotor ve ?D faktör etkileşimlerinin in-vitro olarak açıklanabilmesi için, AC6 ve B. subtilis ?D proteinleri ve B. subtilis kor RNAP enzimi saflaştırıldı. Yapılan in vitro transkripsiyon deneyleri sonucunda, AC6 ve B. subtilis ?D proteinlerinin kor RNAP enzimi ile yeniden yapılandığını ve ?D proteinlerinin AC6 hag promotor bölgesinde transkripsiyonu aktive ettiği gösterildi. AC6 hag promotorunun uzun -10 promotor elementi içindeki CGG motifinin ?D proteinin promotor bölgesinin tanınma ve bağlanmasında önemli olduğu tespit edildi.AC6 hag geni mRNA'sının sekonder yapısı incelendiğinde, hag transkriplerinin 5' ve 3' uçlarında stem-loop yapılarının varlığı tespit edildi. AC6 hag geni için tercih edilen kodonların B. subtilis bakterisi için yüksek sıklıkta kullanılan, G. kaustophilus ve G. stearothermophilus bakterileri için düşük sıklıkta kullanılan a.a. kodonları olduğu tespit edildi.