Amsacta moorei entomopoksvirüs protein kinaz geninin karakterizasyonu ve fonksiyonel analizi

Abstract

Amsacta moorei Entomopoksvirüs (AMEV), Poxviridae familyasına ve Entomopoxviridae subfamilyasına ait bir böcek virüsü olup, önemli böcek zararlıları üzerinde yüksek derecede patojenik etki göstermektedir. Ayrıca AMEV, gen ekspresyon ve gen terapi vektörleri olarak kullanılabilmekte ve insan virüslerinin mekanizmalarının anlaşılmasında çalışılabilecek model virüs olması bakımından büyük önem arz etmektedir.AMEV genomik araştırmaları kapsamında yapılan bu çalışmada, AMEV genomunda bulunan serin/treonin protein kinaz bölgesine sahip AMV197 kodlu genin transkripsiyonel ve fonksiyonel analizleri gerçekleştirildi.DNA sentez inhibitörü varlığında enfekte edilen Ld652 hücrelerinden izole edilen mRNA örneklerinin RT-PCR yöntemiyle yapılan transkripsiyonel analizleri, AMV197'nin ?erken? grubu gen olarak ifade edildiğini gösterdi. AMV197'nin zamana bağlı transkripsiyon profili ise gene ait transkripsiyonun, enfeksiyondan 4 saat sonra başladığını, 7. saatte en yüksek seviyeye çıktığını ve bu saatten sonra azalmaya başladığını gösterdi.5' RACE analizi, transkripsiyonun, translasyon başlangıç noktasına göre -54. pozisyonda başladığını gösterdi. 3' RACE analizi sonuçları, AMV 197 geninin translasyon bitiş noktasına (TAA), bir tanesi 21 diğeri 31 baz (aşağıda) uzaklıkta iki transkripsiyon bitiş noktasının bulunduğunu gösterdi.Genin fonksiyonel analizi için, AMV197 geni homolog rekombinasyon ile AMEV genomundan silindi. Oluşturulan rekombinant virüsün (Am?PK/gfp) DNA replikasyonu slot-blot hibridizasyonu yöntemiyle ve enfektivitesi ise EPDA (End Point Dilution Assay) yöntemiyle belirlendi. Bu sonuçlar, protein kinaz geninin AMEV genomundan silinmesi durumunda, DNA replikasyonunun yaban tipe göre 6 saat erken gerçekleştiğini, ancak virüs üretiminin %61 oranında azaldığını göstermektedir.