Geobacillus stearothermophilus 12 suşundan iki farklı alfa-L-arabinofuranosidaz geninin klonlanması, ekspresyonu, saflaştırılması ve karakterizasyonu

Abstract

Gerçekleştirilen bu çalışmada, daha önce yapılan çalışmalarla iki adet arabinofuranosidaz enzimine sahip olduğu belirlenen Geobacillus stearothermophilus 12 bakterisinin bu her iki enzimine ait olan gen dizileri öncelikle ortaya çıkarıldı. Her bir gen bir E. coli ekspresyon vektörü olan pET28a'ya klonlanarak E. coli BL21 pLys hücresi içinde ekspres edildi. Ekspres edilen proteinler sahip oldukları histidin kuyruktan faydalanılarak afinite kromotografisi yardımıyla saflaştırıldı. Saflaştırılan proteinlerin karakterizasyonları gerçekleştirildi. Her iki enzimin de 56-57 kDa civarında olduğu, optimum çalışma sıcaklıklarının birbirlerinden farklı olup Abf1'in optimum olarak 65°C'de, Abf2'nin ise 50°C'de aktivite gösterdiği, optimum çalışma pH'larının ise Abf1'in 6,5; Abf2'nin ise 5,5 olduğu belirlendi. Abf 1'in 6,0'nın üzerindeki pH'larda uzun süre kararlı olduğu, buna karşı Abf2'nin pH kararlılığının iyi olmadığı tespit edildi. Her iki enzimin de subtrat olarak p-NP α-L arabinofuranosidden başka bir substratı kullanmadığı görüldü.