Thermus sp. K6' dan yeni, kriptik, küçük, çok kopyalı bir plazmitin (pHIG22) izolasyonu ve kısmi karakterizasyonu

Abstract

Bu çalışmada, Alangüllü (Aydın) Kaplıcası'ndan alınan su ve çamurlu su örneklerinden izole edilen iki izolatın cins tayini yapılmıştır. Thermus cinsine ait olduğu belirlenen 2 bakteriden plazmit izolasyonu yapılmıştır.Thermus sp. K6 ve Thermus sp. M5 olarak adlandırılan iki izolattan yapılan plazmit izolasyonu sonucu Thermus sp. K6 bakterisinden izole edilen plazmitin tüm baz sırası elde edildi. İzole edilen plazmitin 2222 bp büyüklükte, %63 GC içeriğine sahip, çok kopyalı, cryptic bir plazmit olduğu belirlendi. İlk kez tanımlanan bu plazmit pHIG22 olarak adlandırıldı.pHIG22 için yapılan BLAST araştırmaları sonucunda, GenBank'ta herhangi bir plazmit veya diziye benzerlik elde edilemedi. Yapılan biyoinformatik analizler sonucunda; genom üzerinde muhtemel 5 ORF bölgesi belirlendi. Belirlenen ORF'lerden; 426 bp olan ORF-1 ve 741 bp olan ORF-2 ana zincirde, 696 bp olan ORF-3, 387 bp olan ORF-4 ve 741 bp olan ORF-5'in de tamamlayıcı zincirde olduğu belirlendi. Yapılan promotor analizi sonucu pHIG22'nin tamamlayıcı zincirinde 2 promotor bölge tespit edildi.pHIG22, pUC18 klonlama vektörü ve kanamisin kaseti birleştirilerek E.coli-Thermus shuttle vektörü oluşturuldu. pHIG22 genomundan belirli diziler PCR ile çoğaltılarak pET28a+ vektörüne klonlandı. Oluşturulan rekombinant plazmitler ile termofilik bakterilere transformasyon çalışmaları yapıldı.