Bacillus thuringiensis Xd3'e ait cry3Aa geninin klonlanması, karakterizasyonu ve ekspresyonu

Abstract

Bacillus thuringiensis, bazı böcek gruplarına karşı insektisidal özelliğe sahip kristal yapıda toksin üreten bir toprak bakterisidir. Bu özelliğinden dolayı Cry (?-endotoksin) proteinleri biyolojik mücadele açısından büyük önem taşımaktadır.Bu çalışmada bir fındık zararlısı olan Xyleborus dispar'dan izole edilmiş Bacillus thuringiensis bakterisinden (Bt Xd3) elde edilen cry3Aa geninin farklı bir konak olan Escherichia coli'ye klonlanması, karakterize edilmesi, ekspresyonu ve insektisidal aktivite testi gerçekleştirilmiştir.Bunun için cry3Aa geni Bt Xd3 bakterisinden PCR ile çoğaltıldı. Çoğaltılan genin nükleotid dizilimini belirlemek için PCR ürünü pGEM-T Easy klonlama vektörüne klonlandı. cry3Aa geninin DNA ve aminoasit dizilimi belirlendi ve mevcut cry3Aa genleri ile karşılaştırıldı.Bu bakteriye ait Cry3Aa proteininin literatürdeki Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis (morrisoni)'in sahip olduğu Cry3Aa2, Cry3Aa3, Cry3Aa5 ve Cry3Aa6 ile %100 benzer olduğu belirlendi. Bt Xd3 cry3Aa gen sırası gen bankasına cry3Aa12 numarası ile geçirildi.cry3Aa geni tarafından üretilen proteini farklı bir konakta ekspres etmek ve aktivitesini belirlemek için gen, ekspresyon vektörü olan pET-28a(+)'ya klonlandı. Ekspresyon vektöründe ekspres edilen protein izole edildi ve proteinin SDS-PAGE analizi yapıldı. Jel üzerinde cry3Aa genine ait 73kDa'luk protein bandı gözlendi.Elde edilen bu Cry3Aa ?-endotoksininin Coleoptera ordosuna ait Alphitobius diaperinus larvalarına karşı olan insektisidal etkileri belirlendi. Yapılan insektisidal aktivite testi sonucunda E.coli BL21(DE3)'de ekspres edilen rekombinant proteinin larvalar üzerinde B. thuringiensis'teki spor-kristal karışımından daha az etkili olduğu tespit edildi.