Anoxybacillus gonensis ksiloz izomeraz H99E mutantının saflaştırılması ve karakterizasyonu

Abstract

D-ksiloz izomeraz (D-ksiloz ketol-izomeraz, E.C. 5.3.1.5) yaygın olarak D-glukoz izomeraz olarak da adlandırılır. Ksiloz izomeraz (KI) hücre içinde D-ksilozun D-ksiluloza izomerizasyonunu, hücre dışında D-glukozun D-fruktoza izomerizasyonunu katalizler. KI/GI endüstriyel olarak oldukça önemli bir enzimdir. Çünkü enzim hem D-glukozu D-fruktoza izomerize ederek HFCS üretiminde kullanılır hem de D-ksilozu alkole fermente olabilen D-ksiluloza izomerize etmesi nedeniyle önemlidir. Sahip olduğu yüksek ticari önem nedeniyle enzimin mikroorganizma kaynakları, özellikleri, çalışma mekanizması, özelliklerinin iyileştirilmesi ve immobilizasyonu gibi konular yoğun bir şekilde çalışılmaktadır. Bu çalışma Aoxybacillus gönensis ksiloz H99E mutantının saflaştırılmasını ve karakterizasyonunu içermektedir. Bu çalışmada mutant tip gen ürünü ışı şoku, iyon değişimi kolon kromatografisi ve hidrofobik etkileşim kolon kromatografisi uygulamalarıyla saflaştırıldı ve elde edilen saf enzim karakterize edildi. KI H99E mutantının glukoz izomeraz ve ksiloz izomeraz aktivitesi için optimum sıcaklıkları 85°C olarak ölçüldü. KI H99E mutantının glukoz izomeraz ve ksiloz izomeraz aktivitesi için optimum pH'larıda 6,5 olarak ölçüldü. KI H99E mutantının glukoz aktivitesi için Km'si 589,97 ± 10 mM, Vmax 5,92 ± 2 µmol/dk/mg hesaplandı. KI H99E mutantının ksiloz aktivitesi için Km değeri 31,88 ± 10mM, Vmax değeri 6,52 ± 2 µmol/dk/mg olarak hesaplandı. KI H99E mutantının optimum çalışma sıcaklığı olan (85°C) ve optimum pH'da (pH 6,5), glukoz izomeraz aktivitesinin yarısını 2 saatte kaybettiği belirlendi. Ksiloz izomeraz aktivitesinin ise 3,5-4 saat sonunda yarıya düştüğü belirlendi. Ayrıca pH 6 ve 6,5'da (4°C) 10 saat sonunda KI H99E mutantının glukoz izomeraz ve ksiloz izomeraz aktivitesini kaybetmediği belirlendi.