HPLC analizinde çakışan pik veren bileşiklerin DAD, on-line FRAP ve peroksinitritle reaksiyon kullanılarak ayırt edilmesi

Abstract

Bu çalışmada, 16 fenolik asit standardı (rosmarinik asit, benzoik asit, p-OH benzoik asit, protokatekuik asit, protokatekualdehit, syringik asit, sinapik asit, p-kumarik asit, ferulik asit, kafeik asit, gentisik asit, vanilik asit, vanilin, gallik asit, syringaldehit, klorogenik asit) 25 °C'de, çözücü gradienti ve süre faktörleri değiştirilerek çakıştırıldılar. DAD ile çakışan bileşen analizleri yapıldıktan sonra fenolik asitlerin yerleri belirlendi. Aynı yerde pik veren fenolik asitlerin spektrum farklılıklarından ayırt edilmesi sağlandı. Çakışan pikler için farklı dalga boylarındaki absorbans oranlarına karşılık gelen yüzde bileşim grafikleri oluşturularak karışımdaki bileşimler bulundu. Fenolik asitlerin çakışma durumunda ayırdedilebilecekleri dalga boyları belirlendi ve standartların çakışmayacağı karışımlar hazırlandı, on-line FRAP'la 10 farklı konsantrasyonda antioksidan aktiviteler belirlendi. Klorogenik asit ? p-OH benzoik asit ve vanilik asit ? kafeik asit ikililerinin kalitatif ayrımı sadece klorogenik asit ve kafeik asitin aktif olması sayesinde 595 nm'de gerçekleşti. Vanilin ? p-kumarik asit ikilisinin herikisinin de aktivitesinin olmamasından dolayı bu yöntemle ayrımı gerçekleştirilemedi. Gentisik asit ? protokatekualdehit ve ferulik asit ? sinapik asit ikililerinde ise her iki bileşen de aktif olduğundan, 280 nm ve 595 nm'deki pik alanları oranlarından çizilen grafikler yardımıyla karışımdaki yüzde molar bileşimleri hesaplandı. Ayrıca standartlar, laboratuvarda sentezlenen peroksinitritle tek tek, off-line olarak hem pH 7.4'te hem de peroksinitritin 1 M HCl ile reaktivitesi durdurularak muamele edilip HPLC' de yürütüldüler ve fenolik asit pik kaybolması veya dönüşüme uğramasıyla da fenolik asitler ayırt edildiler. In this study, 16 phenolic acids (rosmarinic acid, benzoic acid, p-OH benzoic acid, protocatecuic acid, protocatecualdehyde, syringic acid, synapic acid, p-cumaric acid, ferulic acid, caffeic acid, gentisic acid, vanillic acid, vanilline, gallic acid, syringaldehyde, chlorogenic acid) were overlapped by changing solvent gradient and time at 25 °C. After the analysis of the overlapping peaks with DAD, the retention times of the phenolic acids were determined. The phenolic acids having overlapping peaks were resolved by spectral differences. For the overlapping phenolic acids, compositions were determined from the graphs of percentage composition versus absorbance ratios at selected wavelengths. The wavelengths at which resolution could be attained were determined, the standard mixtures with non-overlapping composition were prepared, and on-line FRAP activities of phenolic acids at ten different concentrations were determined. Qualitative seperation of chlorogenic acid ? p-OH benzoic acid and vanilic acid ? caffeic acid pairs was realised from the peaks at 595 nm as only one was active, i.e. chlorogenic and caffeic acids. Vanillin ? p-cumaric acid pair could not be resolved as both were inactive. Because both components of gentisic acid ? protocatecualdehyde and ferulic acid ? synapic acid pairs were active, %molar compositions of these pairs were calculated from the graphs of ratios of peak areas at 280 and 595 nm versus component percentage. Additionally, standards were reacted with peroxynitrite separately at pH 7.4 and after inactivating peroxynitrite by premixing with 1 M HCl and then injected to HPLC system, and peaks were resolved based on reactivities towards peroxynitrite with peak disappearings and peak transitions.