eni bir termofilik bakterinin, Anoxybacillus gonensis A4, hücredışı lipaz/esteraz yeteneğinin incelenmesi ve karakterizasyonu

Abstract

Bu çalışmada yeni bir termofilik bakteri olan Anoxybacillns gonensis A4 (A. gonensis A4) susunun esterolitik aktivitesi incelendi. Ester bağlarını hidrolizleyen hücre dışı bir enzimin varlığı tributirin-agar testi ile belirlendi. Tributirinli petrilerde büyütülen A. gonensis A4 izolatı etrafında berrak bölgelerin oluşması bu termofilde bir esterazm varlığını desteklemektedir. %0,3 karboksimetilselüloz Luria-Bertani (LB) besiyerinde büyümeyi ve spektrofotometrik olarak belirlenen esteraz aktivitesini artırdı. Substrat özgünlük çalışmaları, A. gonensis A4 susundan hazırlanan hücredışı enzim özütünün, kısa zincirli /?-nitrofenil (PNP) esterlerini hidrolizleme kabiliyetinin uzun zincirli p-nitrofenil (PNP) esterlerini hidrolizleme kapasitesine göre daha yüksek olduğu saptandı. A. gonensis A4 susu hücredışı esterazının optimum sıcaklığı yaklaşık 80 °C, optimum pH'ı ise 5,5 olarak belirlendi. Isıl kararlılık eğrisi incelendiğinde, enzimin 30 dakika 30-70 °C arasındaki sıcaklıklarda inkübasyonuyla aktivitesinin yaklaşık %20 oranında arttığı gözlendi. Metal iyonlarının A. gonensis A4 susu hücredışı esteraz enzimi aktivitesi üzerine etkisini incelemek amacıyla nihai konsantrasyonu 1 mM olacak şekilde 11 farklı metal klorür tuzu kullanıldı. Enzim aktivitesi K+ varlığında %15 artış gösterdi ve diğer metal iyonlarının bazıları aktivite üzerinde hiçbir etki göstermezken diğer bazılarının aktiviteyi düşürdüğü gözlendi. Fenilmetilsülfonilflorür tarafından inhibisyon katalitik aktivitede önemli bir rol oynayan kritik bir serin amimoasidinin varlığını desteklemektedir. Elde edilen sonuçlar, A. gonensis AA susunun, genel olarak önceden belirtilen esterazlara benzer özelliklere sahip yüksek derecede ısıl kararlı bir gerçek esteraz salgıladığını göstermektedir. Investigation of Esterase Capabilities of a Novel Bacterium, Anoxybacillus gonensis A4 In this study, esterolytic activities of a novel thermophilic bacterium, Anoxybacillus gonensis A4 strain, were investigated. Occurence of an extracellular enzyme that hydrolyzes ester bonds was dedected by tributyrin agar assay. Formation of clear zones around A. gonensis A4 isolates on agar plates containing tributyrin also supported the presence of an esterase in this thermophile. 0.3% Carboxymethylcellulose stimulated both the growth in Luria-Bertani (LB) medium and the esterase activities determined spectrophotometrically using /7-nitrophenylbutyrate as substrate. The extracellular crude enzyme prepared from A. gonensis cultures showed greater substrate specicifities for short chain /7-nitrophenylesters than those for long chain /7-nitrophenylesters. The temperature optimum of A. gonensis A4 extracellular esterase was found to be nearly 80 °C and its pH optimum was dedected to be 5.5. When thermostability data was examined, it was seen that the esterolytic activity was stimulated at about 20% levels at temperatures ranging from 30 to 70 °C after 30 minutes of incubation. The effectiveness of various metal ions on the enzyme activity was tested for chloride salts of 1 1 metal ions at final concentration of 1 mM. In the presence of K+, the activity was enhanced at about 15%. The other ions had either no effect on esterase activities or possessed different inhibition profiles. Inhibition by phenylmethylsulphonylfluoride supported the presence of a critical serine residue thought to be significant for catalytic activity. All these results support that Anoxybacillus gonensis A4 strain excretes a highly thermostable true esterase possesing interesting characteristics some of which are similar to esterases reported earlier.