Termofilik Geobacillus sp. TF16 suşundan fitaz enziminin saflaştırılması, karakterizasyonu ve doğal bir besin kaynağındaki fitatı parçalama etkinliğinin incelenmesi

Abstract

Bu çalışmada endüstriyel önemi olan fitaz enzimi yeni tanımlanmış bir termofilik bakteri türü olan Geobacillus sp. TF16'dan amonyum sülfat çöktürmesi, iyon değişim kromatografisi teknikleri ile 4,93 kat saflaştırıldı. Saflaştırılan enzim SDS-PAGE ile analiz edildiğinde 106,04 kDa molekül ağırlığına sahip tek bir protein bandı tespit edildi. Saflaştırılan enzim sodyum fitat substratı varlığında 85 °C'de pH 4,0'de optimum sıcaklık ve pH'ya sahip olduğu ve optimum pH değerinde enzim 4, 37 ve 85 oC'de 24 saat sonunda aktivitesini yaklaşık olarak %80'nin üzerinde koruduğu tespit edildi. Fitaz enziminin ısıl kararlılığı incelendiğinde, 4 oC'de 24 saat sonunda ve 37 oC ve 85 oC'de 4 saat sonunda aktivitenin büyük oranda korunduğu tespit edildi. Sodyum fitat substratı için enzimin kinetik parametreleri olan Vmaks ve Km değerlerinin sırasıyla 526,28 U/mg ve 1,31 mM olduğu hesaplandı. Metal iyonlarının varlığında enzim aktivitesinin büyük oranda korunduğu, Cu2+ mevcudiyetinde aktivitenin 5 kat arttığı, EDTA mevcudiyetinde ise kısmen azaldığı tespit edildi. Proteaz enzimleri varlığında Geobacillus sp. TF16 fitazının %62 oranında aktivitesini koruduğu saptanmıştır. Geobacillus sp. TF16 fitazının soya sütü fitatını parçalama etkinliği incelenerek 4 saat sonunda fitaz enzimi yaklaşık %20 oranında hidrolizleme yeteneğine sahip olduğu tespit edildi. In this study, phytase was purified from Geobacillus sp. TF16 by using ammonium sulfate precipitation and DEAE ion exchange chromatography. Phytase enzyme was purified 4.93 fold by chromatography techniques. The purified enzyme was determined as a single band 106.04 kDa on SDS-PAGE. Temperature and pH optimums of purified enzyme were found to be 85 oC and 4.0, respectively. The enzyme activity is preseved approximately %80 after 24 hours incubation at 4 oC, 37 oC and 85 oC. In the study of thermal stability, enzyme activity was conserved approximately %60-80 at 4 oC after 24 hours and at 85 ° C and 37 °C after 4 hours. Sodium phytate as a substrate Vmax and Km values were calculated as 526.28 U/mg and 1.31 mM, respectively. Additionally, it was detected that some metal ions affect the enzyme activity at different ratios. In the presence of EDTA, enzyme activity was inhibited slihtly. In the presence of proteases, it is conserved the activity approximately %62 at 37 oC after 1 hour incubation. The enzyme hydrolized approximately %20 of soymilk phtate at 85 oC after 4 hours.