Termofilik Geobacillus caldoxylosilyticus TK4 suşundan fosfotriesteraz homolog proteinin klonlanması, ekspresyonu ve karakterizasyonu

Abstract

TÜBİTAK, 106T696 nolu proje kapsamında gerçekleştirilen bu çalışmada, yeni bir termofilik suş olan Geobacillus caldoxylosilyticus TK4'den bir genomik DNA kütüphanesi oluşturuldu. Bu kütüphaneden elde edilen veriler ve bu verilere dayanılarak yapılan invers PCR sonucunda, 921 bazdan oluşan G. caldoxylosilyticus TK4 fosfotriesteraz homolog protein (PHP) geninin tamamının DNA sırası belirlendi. Elde edilen bu sıra GenBank veri tabanında FJ788931 numarası ile depolandı. Protein sırasının, BLAST programında incelenmesi sonucunda, bu proteinin fosfotriesterazlar (PTE'ler) ve putatif PTE'lere değişik oranlarda benzediği görüldü. PHP geni, pET-28a(+) vektörüne klonlandıktan sonra, Escherichia coli BL21(DE3)pLysS'de ekspres edildi. N ucunda 6 tane histidin içeren PHP, nikel afinite kromatografisi ile saflaştırıldı. Ekpres edilen rekombinant polipeptidin molekül ağırlığının, SDS-PAGE ile yaklaşık 36,5 kDa olduğu belirlendi. Aktivite tayini çalışmalarında, paraokson ve paratiyon varlığında herhangi bir aktivite elde edilemezken, denenen diğer substratlar içinde en yüksek aktivite, pNPA ve pNPB varlığında gözlendi. pNPA varlığında enzimin optimum pH ve sıcaklığı, sırasıyla 8,0 ve 50 °C olarak bulunurken, Km ve Vmaks değerleri ise sırası ile 0,17 mM ve 1667 U/mg protein olarak hesaplandı. Rekombinant PHP'nin, 50 °C'de, pH 3,0-9,0 aralığındaki tamponlarda ayrı ayrı 7 gün inkübe edilmesiyle, aktivitesini büyük oranda koruduğu gözlendi. Enzim, 90 °C'de 7 gün inkübasyon sonunda aktivitesini %60 oranında korudu. Reaksiyon karışımlarına %10 nihai konsantrasyonda etanol, izopropanol, asetonitril, aseton ve DMSO ilave edildiğinde aktivitede azda olsa bir artış meydana geldiği görüldü. Bu sonuçlar, oldukça pH ve ısıl kararlı bir esteraz aktivitesine sahip ilk PHP olan bu enzimin, endüstriyel uygulamalar için çok önemli bir potansiyele sahip olabileceğini göstermektedir. In this study, supported by TUBITAK (Project number is 106T696), a genomic DNA library was constructed from the thermophilic Geobacillus caldoxylosilyticus TK4 strain. The whole DNA sequence, available in the GenBank database under the accession number FJ788931, of the G. caldoxylosilyticus TK4 phosphotriesterase homology protein (PHP) gene consisting of 921 bp was determined by performing inverse PCR. Sequence alignments done with BLAST programme indicated that the amino acid sequence of the G. caldoxylosilyticus TK4 PHP was similar to phosphotriesterases (PTEs) and putative PTEs in different ratios. The gene was cloned into pET-28a(+) vector and expressed in Escherichia coli BL21(DE3)pLysS. The recombinant protein containing 6xHis tag at the N- terminus was purified by using nickel affinity chromatography. The molecular weight of the recombinant polypeptide was found to be 36.5 kDa with SDS-PAGE. Whereas the enzyme did not have any activity in the presence of paraoxon and parathion, the highest activities were observed with pNPA and pNPB. The optimum pH and temperature of the enzyme were determined as 8.0 and 50 °C, respectively, in the presence of pNPA. Km and Vmax values were calculated as 0.17 mM and 1667 U/mg protein, respectively. When the enzyme was separately incubated at 50 °C in the buffer solutions (pHs ranging from 3.0-9.0) for 7 days, the activity was mainly retained. The enzyme retained about 60% of its original activity after 7 days of incubation at 90 °C. In the presence of 10% ethanol, isopropanol, acetonitrile, acetone, and DMSO, the enzyme activity slightly increased. It is clear from the present results that the enzyme, which is the first PHP showing an extremely pH- and thermo- stable esterase activity, might have a very important potential for industrial applications.