Mersin balığı (Acipenser gueldenstaedti) eritrositlerinden elde edilen karbonik anhidraz enziminin saflaştırılması, karakterizasyonu ve kinetik özelliklerinin incelenmesi

Abstract

Bu çalışmada mersin balığı (Acipenser gueldenstaedti) eritrositlerinden Karbonik anhidraz enzimi ilk kez saflaştırılmış ve karakterizasyon çalışmaları yapılmıştır. Enzim Sefaroz-4B-L tirozin-sülfanilamid kolonundan balık kanına göre 539 kat ve %29 verimle saflaştırılmıştır. Mersin balığı eritrositlerinde tek izoenzimin olduğu ve spesifik aktivitesinin 26943 EUxmg-1 olduğu tespit edilmiştir.Enzimin saflığını ve alt birim molekül kütlelerini tespit etmek için sodyum dodesilsülfat poliakrilamid jel elektroforezi(SDS-PAGE) yapılmış ve tek alt birimden oluştuğu gözlenmiştir. Enzimin alt birim molekül kütlesi 29 kDa olarak tespit edilmiştir. Enzimin esteraz aktivitesine göre pH 9.0' da 30 0C sıcaklıkta ve 0.05 M Tris-SO4 tamponunda optimum aktivite gösterdiği bulunmuştur. Enzimin Km ve Vmax kinetik değerleri p-nitrofenil asetat (p-NFA) substratı kullanılarak Lineweaver-Burk grafiğine göre hesaplanmış ve sırasıyla Km 4 mM ve Vmax 20 mM/dakika olarak tespit edilmiştir. Enzimin etkinliğini belirlemek için kcat ve kcat/Km değerleri belirlenmiştir. p-NFA'a karşı kkat değeri 20,8 s-1 olarak bulunmuştur. Enzimin sülfanilamid ve asetazolamid inhibitörlerine karşı 4.0 ?M ve 0.1 ?M gibi oldukça düşük IC50 değerine sahip olduğu bulunmuştur. IC50 , enzimin %50'sini inhibe eden inhibitör konsantrasyonu olup düşük IC50 yüksek inhibisyon değerini göstermektedir. Ayrıca enzimin Zn+2, Cu+2, Co+2 ve Ag+ iyonları tarafından değişen IC50 değerlerlerinde inhibe olduğu belirlenmiştir. Ayrıca çevresel kirlilik oluşturan bazı pestisitler tarafından hidrataz aktivitesine göre değişen IC50 değerlerinde inhibe olduğu tespit edilmiştir. In this study, sturgeon erytrocyte purification and characterization of carbonic anhydrase (CA) have been performed for the first time. The enzyme was purified from sepharoze 4-B L-tyrosine-sulphanilamid column by a purification 539-fold and %29 yield. The specific activity of the enzyme was measured as 26943 EUxmg-1.SDS gel electrophoresis was applied to determine the purification of the enzyme and subunit molecular weights and observed as a single band. The subunit molecular weight of the enzyme was evaluated as 29 kDa. It was shown that the enzyme performes best at a pH 9.0 and 30 0C in 0.05 M Tris-SO4 buffer. Km and Vmaks kinetic values were evaluated using p-NPA through Lineweaver-Burk graphic and measured as 4 mM for Km and 20 mM/min for Vmax respectively. For determining the efficacy of the enzyme kcat and kcat/Km values was evaluated.p-NPA kcat value was calculated as 20.8 s-1. It was found that the enzyme has a IC50 value of 4 ?M and 0.1 ?M for sulphanilamid and asetazolamid inhibitors. IC50 is the inhibitor concentration which inhibits the 50 percent of the enzyme and low IC50 value shows high inhibition rate. It was shown that the enzyme is inhibited by Zn+2, Cu+2, Co+2 and Ag+ ions at different IC50 values. It was also shown that the enzyme is inhibited by some pesticides which cause environmental pollution at different IC50 values which have the changing hydratase activity.