HPLC ile proteinlerin ayrılmasında dedeksiyon amaçlı yeni on-line yöntemin geliştirilmesi ve gıda ve ilaç analizinde uygulanması

Abstract

Protein tayininde kullanılan mevcut UV-Vis spektrofotometrik yöntemlerin taraması yapıldıktan sonra, bu yöntemlerden üstün validasyon özelliklerine sahip olanların HPLC ile protein ayrılmasına uyarlanması sayesinde kolon sonrası reaktif enjeksiyonuyla kantitatif protein tayininin yapılabileceği on-line HPLC-Protein tayin sistemi (On-line HPLC-Biüret, On-line HPLC-Ninhidrin, On-line HPLC-Bradford) geliştirilmesi amaçlanmıştır. Bu yöntemlerden dedeksiyon açısından üstün olan On-line HPLC-Bradford yöntemi ile ayırım sonrası 595 nm'de kantitatif miktar belirleme mümkün olmuş, 280 nm'deki yarı kantitatif ölçüme göre daha güvenilir ölçümlere imkan sağlanmıştır. Bilinen çeşitli standart protein numunelerinin (CA ve BSA proteinleri) kullanılmasıyla on-line yöntemin optimize edilmesinden sonra tayin ve tespit sınırları belirlendi ve gıda (jelatin proteini) ve biyofarmasötik ilaç (insülin, immünglobulin G proteinleri) proteinlerinin boyut dışarılama kolonu ile kantitatif tayini gerçekleştirilmiştir. Ayrıca organik çözücü sistemlerinin (metanol, etanol, asetonitril) proteinler (CA, BSA, immünglobulin G, insülin) ve Bradford reaktifi ile birlikte on-line HPLC'de izokratik ya da gradient uygulamaları farklı kolon sistemleri için model teşkil etmesi amacıyla % kompozisyonları değiştirilerek spektrofotometrik analizleri yapılmıştır. 0.3 mL/dk akış hızı, 70 mg/L reaktif konsantrasyonu, 30 °C sıcaklık ve 2.5 m tubing uzunluğu optimum olarak belirlenmiştir. Ayrıca son karışımda suyun yanında % 10'a kadar organik çözücünün de kullanılabileceği gösterilmiştir. After searching UV-Vis spectrophotometric methods used for protein determination, development of an on-line HPLC-Protein determination system (on-line HPLC-Biuret, on-line HPLC-Ninhydrine, on-line HPLC-Bradford) is sought for by adapting the methods having better validation properties to protein separation with post-column reagent injection. On-line-HPLC-Bradford method, being superior in terms of detection, provided better quantitative determination at 595 nm after protein separation in comparison to the semi-quantitative protein determination at 280 nm. By using various standard protein samples (CA and BSA proteins) the new method was optimized, limit of detection and limit of quantification values were determined, and quantitative determination of food (gelatin) and biopharmaceutic drug (insulin and immunoglobulin G) polypeptides were achieved by using size-exclusion column. In addition organic solvent systems (methanol, ethanol, acetonitrile) were evaluated spectrophotometrically by changing % compositions in order to show a model for the interaction with the determination of proteins (CA, BSA, immunglobuline G, insuline) and Bradford reagent in the on-line HPLC system for isocratic or gradient applications and different column systems. Optimization results were obtained as 0.3 mL/min reagent flow rate, 70 mg/L reagent concentration, 30 °C temperature and 2.5 m tubing length. It was also shown that all organic solvents below 10% mixing ratio can be used.