Anoxybacillus gonensis glukoz izomerazının genetik manipulasyonlarla bazı biyokimyasal özelliklerinin geliştirilmesi

Abstract

Glukoz izomeraz (D-ksiloz ketol izomeraz; EC 5.3.1.5), büyümek için karbon kaynağı olarak ksilozu kullanabilme yeteneğine sahip, birçok bakteride bulunan hücre içi bir enzimdir. Glukoz izomeraz, D-ksilozun D-ksiluloza dönüşümünü katalizlediği gibi D-glukozun D-fruktoza dönüşümünü de katalizlemektedir. Bu ikinci özelliği HFCS (fruktoz şurubu) üretiminde endüstriyel alanda kullanılmaktadır. Glukoz izomeraz bugün dünyada ticari amaçla en çok kullanılan üç enzimden biridir.Bu çalışmada, Anoxybacillus gonensis G2T glukoz izomeraz geni klonlanarak izole edildi ve baz dizilimi belirlendi. İzole edilen gen, pET-28a(+) ekspresyon vektörüne klonlanarak E. coli BL21(DE3) suşu içerisinde yüksek miktarlarda üretildi. Bütün glukoz izomerazlar, amino asit dizilimleri açısından, oldukça korunumlu bazı bölgelere sahiptirler. Bu bölgeler incelenerek, bölge özgün mutasyon yöntemiyle, klonlanan glukoz izomeraz üzerinde W137F, V184T, V184S, H99Q, H99N, H99D, H99E ve H99L mutasyonları yapıldı. Yaban tip ve mutant enzimler kolon kromatografisi yöntemiyle saflaştırıldı ve karakterize edildi. Tüm mutant enzimler yaban tip enzim ile biyokimyasal özellikleri ve kinetik parametreleri bakımından karşılaştırıldı.Yaban tip enzimin optimum pH'sı 6,5, optimum sıcaklığı 85°C, Km'si 146,08 ± 9,50 mM ve Vmax'sı ise 43,72 ± 1,01 µmol/dk/mg protein olarak belirlendi. Yapılan W137F mutasyonu ile Km değeri 64,02 ± 2,10 mM'a düşürüldü. V184T, V184S mutasyonları enzim kinetik parametrelerinde önemli bir değişiklik meydana getirmezken genel olarak H99 ile yapılan mutasyonlar sonucu enzimin Km değerinde bir artış Vmax değerinde ise bir azalış gözlendi. Yapılan W137F/ V184S mutasyonu ile Km değeri 39,29 ± 2,87 mM'a düşürüldü.