Chilo iridescent virüsün Bombyx mori hücre kültüründe replikasyonu ve dnapol ile mcp genlerinin transkripsiyonal analizi

Abstract

Chilo iridescent virüs (CIV) îridoviridae familyası içerisindeki Iridovirüs cinsinin ömek türü olup, önemli böcek zararlıları üzerinde yüksek derecede patojenik etki gösterir. Bu çalışma, CIV'nin Bombyx mori (SPC-BM-36) hücrelerinde replikasyonunun gösterildiği ilk çalışmadır. Ayrıca ClV'ye ait genlerin regülasyonu üzerinde çalışmalar yapıldı. Bunun için DNA polimeraz {dnapol) ve major kapsid proteini (mcp) genleri seçildi. Bu genlerin temporal sınıflan ve proteine dönüşmeyen baz sıralan belirlendi. Muhtemel promotor bölgelerinin belirlenmesi üzerinde detaylı çalışmalar yapıldı. CIV'nin B. mori hücrelerindeki replikasyonu ışık mikroskobu ile, DNA-DNA hibridizasyonu ile ve transkripsiyona! olarak belirlendi. CIV'nin B. mori hücrelerini enfeksiyonunu takip eden 48. saatte, hücrelerin enfekte olmamış kontrol hücrelerden tamamen farklılık gösterdiği tespit edildi. Sonuçlar CIV-Bm enfeksiyonunun duyarlı olduğunu göstermektedir. Enfekte olan hücrelerin kontrollere göre 2-3 kat daha büyük oldukları ve içlerinde küçük sitoplazmik boşluk oluştuğu belirlendi. B. mori hücrelerinin Ara-C (DNA replikasyonu engelleyicisi) ve siklohekzimit (protein sentezi engelleyicisi) varlığında enfeksiyonu, izole edilen total RNA üzerinde dnapol ve mcp için özel primerler kullanılarak yapılan RT-PCR ile takip edildi ve sonuç dnapoVün "erken" mçp'nin de daha önce belirtildiği gibi "geç" grubu gen olarak ifade edildiğini gösterdi. CIV ile enfekte olmuş B. mori hücrelerinden izole edilen RNA üzerinde yapılan 5'-RACE analizi, transkripsiyonun, translasyon başlangıç noktalarına göre dnapol için -35., mcp için de - 15./- 16. pozisyonda başladığım gösterdi. Bu genlerin muhtemel prömotorlarının sınırlarını tayin etmek için, çeşitli uzunluklardaki 5'-dizileri, ateşböceği lusiferaz işaret geninin önüne klonlandı. Oluşan plazmit yapılan transfeksiyon deneyinde test edildi, mcp promotor akti vitesi translasyon başlangıç noktasının yukarısındaki sıralar -67. nükleotidden -43. nükleotide indirildiğinde güçlü bir şekilde düştü, dnapol için ise promotor aktivitesi, translasyon başlangıç noktasının yukarısındaki sıralar -62. 'den -41. nükleotide indirildiğinde hemen hemen sıfırlandı. Translasyon başlangıç noktasının yukansmda bulunan TTGTTTT motifindeki G bazının C ile değiştirilmesi, promotor aktivitesini % 25 oranında düşürdü.