Yüksek sıcaklık ve PH'da aktif yeni bir kimerik ksilanazın oluşturulması ve karakterizasyonu

Abstract

Bu çalışmada, Bacillus halodurans C-125 ve Geobacillus sp. TF16 ksilanaz genleri PCR'la çoğaltıldı. Bu genler PGEMT-Easy vektörüne klonlandı ve sekans analizi yapılarak istenen gene ait diziler oldukları belirlendi. Daha sonra B. halodurans C-125 bakterisine ait ksilanaz geni E. coli ekspresyon vektörü olan pET20b(+)'ye aktarıldı. Fakat B. halodurans C-125 ksilanazında ekspresyon görülmedi. Geobacillus sp. TF16 ksilanaz geni ise pET20b(+) vektörüne aktarılamadığından, ksilanaz proteini bakteriden doğrudan elde edildi. TF16 ksilanazı amonyum sülfat çöktürmesi ve iyon değişimi kolon kromatografisi kullanılarak saflaştırıldı. TF16 ksilanaz enzimi optimum pH, optimum sıcaklık ve kinetik parametreler açısından değerlendirildi. Enzimin optimum pH'sı; 9.0, optimum sıcaklığı; 70 °C, Km; 6,86± 0,615 mg/ml, Vmax; 720,24± 22,99 U/mg olarak hesaplandı. B. halodurans C-125 ve Geobacillus sp. TF16 ksilanaz genleri kullanılarak DNA shuffling yöntemini temel alan bir yaklaşımla kimerik ksilanaz genleri oluşturuldu. Bu kimerik genler; GeoInH2CTer, GeoInH2CTer2, GeoIntraH2Int3 ve GeoIntraH2Int4 olarak isimlendirildi. Kimerik genler pET28a(+) ekspresyon vektörüne aktarılarak, E. coli BL21 (DE3) suşu içerisinde çoğaltıldı. Aktarım sonucunda GeoIntraH2Int3 ve GeoIntraH2Int4'de ekspresyon görülürken, GeoInH2CTer, GeoInH2CTer2'de ekspresyona rastlanmadı. GeoIntraH2Int3'ün optimum sıcaklığı 60 °C, pH'sı 8,0, GeoIntraH2Int4'ün optimum sıcaklığı 50-60 °C, optimum pH'sı ise 8,0-10,0 olarak bulundu.