Geobacillus sp. 71 endoksilanaz geninin klonlanması, ekspresyonu ve enzimin karakterizasyonu

Abstract

Ksilan, doğada ikinci sırada sıklıkta bulunan bir polisakkarittir. Endoksilanazlar da ksilanın hidrolizinden sorumlu bir enzim grubu olup başta kağıt ve kağıt hamuru endüstrileri olmak üzere endüstride en çok kullanılan enzimlerden biridir. Termofilik mikroorganizmaların ksilanazları sıcaklık ve pH değişikliklerine karşı dirençli olduklarından dolayı endüstiyel süreçlerde önemli rolleri vardır.Bu çalışma da Geobacillus sp. 71 izolatı olarak isimlendirilen termofilik bir bakterinin ısıl kararlı ksilanaz gen sırasının invers PCR yöntemi ile bulunması, bir E. coli ekspresyon vektörüne klonlanması, saflaştırılması ve karakterizasyonu gerçekleştirilmiştir. Geobacillus sp. 71 endoksilanazı kodlayan 1224 nt`lik genin baz dizilimi belirlenerek pET20b+ vektörüne klonlandı. Geni içeren vektör, E.coli BL21 hücresine aktarılarak ksilanaz ekspres edildi ve MagneHisTM Protein Saflaştırma Sistem kiti kullanılarak enzim saflaştırıldı. Saflaştırılan Geo71 Endoksilanaz enziminin optimum çalışma sıcaklığının 75 ºC ve optimum pH'nın ise 7,0 olduğu bulundu. Oat spelt xylan için olan Km değerinin 0,425 mM olduğu ve bu değerin diğer ksilanaz enzimlerine göre daha düşük olduğu belirlendi. Vmaks değeri 500 U/mg olarak belirlendi. Metal iyonlarının ve çeşitli kimyasalların enzime olan etkileri değişik konsantrasyonlarda gerçekleştirilen çalışmalar sonucunda belirlendi ve 10 mM konsantrasyonda Hg2+ bivalent metal iyonunun enzim aktivitesini neredeyse tamamen inhibe ettiği tespit edildi. Enzimin molekül ağırlığı 47 kDa olup amino asit benzerliğine göre family 10 glikosil hidrolaz sınıfı bir enzim olduğu belirlendi. Geo71 endoksilanaz enziminin oat spelt xylan substratını hidrolizlemesi sonucu ortaya çıkan şekerlerin başlıca ksilobioz, ksilotetroz olduğu ayrıca bunların yanında az miktarda da olsa ksilotrioz ve diğer bazı oligosakkaritlerinde oluştuğu ince tabaka kromotografisinde (TLC) ile ortaya çıkarıldı.Elde edilen veriler ışığında, enzimin biyokimyasal özellikleri, enzimin önemli bir endüstriyel enzim olabileceğini göstermektedir.