Anoxybacillus gonensis G2T ksiloz izomeraz geninin klonlanması, gen ürününün saflaştırılması ve karakterizasyonu

Abstract

D-ksiloz izomeraz (D-ksiloz ketol-izomeraz, E.C. 5.3.1.5) yaygın olarak D-glukoz izomeraz olarak da adlandırılır. Ksiloz izomeraz (KI) hücre içinde D-ksilozun D-ksiluloza izomerizasyonunu, hücre dışında D-glukozun D-fruktoza izomerizasyonunu katalizler. KI, endüstriyel olarak oldukça önemli bir enzimdir. Çünkü enzim hem D-glukozu D-fruktoza izomerize ederek HFCS üretiminde kullanılır hem de D-ksilozu alkole fermente olabilen D-ksiluloza izomerize etmesi nedeniyle önemlidir. Sahip olduğu yüksek ticari önem nedeniyle enzimin mikroorganizma kaynakları, özellikleri, çalışma mekanizması, özelliklerinin iyileştirilmesi ve immobilizasyonu gibi konular yoğun bir şekilde çalışılmaktadır.Gönen Kaplıca'sından izole edilmiş termofilik bir mikroorganizma olan Anoxybacillus gonensis G2T KI aktivitesine sahiptir.Bu çalışma; Anoxybacillus gonensis G2T KI pET-28a(+) ekspresyon vektörüne klonlanmasını, gen ürününün ekspres edilmesini, saflaştırılmasını ve saf enzimin biyokimyasal özellikleri belirlenmesini içermektedir.Bu çalışmada, KI gen ürünü E. coli BL21(DE) suşunda ekspres edildikten sonra ışı şoku, iyon değişimi kolon kromatografisi ve hidrofobik etkileşim kolon kromatografisi uygulamalarıyla saflaştırıldı ve elde edilen saf enzim karakterize edildi. Enzimin optimum çalışma sıcaklığı 85°C, optimum pH değeri 6,5 olarak bulundu. Km değeri 25 ±2 mM olarak, Vmax değeri 0,12958±0,002 µmol/dk olarak bulundu. Enzimin aktivite göstermek için Co2+, Mg2+ ve Mn2+ metal iyonlarından en az birine ihtiyaç duyduğu, ancak en yüksek aktiviteyi Mn2+ varlığında gösterdiği bulundu. Ca+2, Hg+2, Ni+2, Zn+2, Fe+2 ve Cu+2 bivalent metal iyonlarının inhibitör etki gösterdiği belirlenmiştir. Enzimin optimum çalışma sıcaklığı olan 85°C'de (pH 6,5), 50 saat sonunda enzim aktivitesinin yarıya düştüğü, pH 6 ve 6,5'da (4°C) enzimin aktivitesini kaybetmediği belirlendi. Enzimin moleküler ağırlığı HPLC ile 180 kDa olarak belirlendi.