Anoxybacillus kestanbolensis AC26sarı suşundan arabinofuranosidaz geninin klonlanması, ekspresyonu ve enzimin karakterizasyonu

Abstract

Bu çalışmada, Anoxybacillus kestanbolensis AC26Sarı suşundan ? -L-Arabinofuranosidaz geninin elde edilmesi, klonlanması, ekspresyonu ve enziminin karakterizasyonu yapılmıştır.Klonlanıp ekspres edilen bu enzimin molekül ağırlığı 57 kDa olup amino asit benzerliğine göre glikosil hidrolaz familya 51 sınıfı bir enzim olduğu belirlendi. Ekpresyon vektörüne (pET28a+) his taq kuyruk içerecek şekilde klonlanan arabinofuranosidaz (Abf) geni Escherichia coli BL21 hücresine aktarılarak enziminin ekspresyonu gerçekleştirildi. MagneHisTM Protein Purification System (Promega) kiti kullanılarak enzim saflaştırıldı ve karakterizasyonu yapıldı. Enzimin çeşitli pH aralıklarında (pH 4.0 - 10.0) ve sıcaklıklarda (40-90?C) gerçekleştirilen çalışmalar sonucu optimum aktivite gösterdiği pH'ın 6.5 ve optimum aktivite gösterdiği sıcaklığın 65?C olduğunu belirlendi. Substrat olarak p-nitrophenyl ? -L-arabinofuranozid ve sugar beet arabinan kullanılarak yapılan kinetik çalışmalar sonucunda Km değerleri sırasıyla 0.139 mM ve 5.21 mg/ml, Vmax değerleri ise sırasıyla 1019 U/mg protein ve 156.25 ? mol olarak belirlendi. Metal iyonlarının ve çeşitli kimyasalların enzime olan etkileri değişik konsantrasyonlarda gerçekleştirilen çalışmalar sonucunda belirlendi ve 1 mM konsantrasyonda Cu2+ ve Hg2+ bivalent metal iyonlarının enzim aktivitesini neredeyse tamamen inhibe ettiği görüldü. Saflaştırılan enzim sugar beet arabinan, rye arabinoxylan, oat spelt xylan ve arabinooligosakkaritleri (arabinobiose, arabinotriose, arabinotetraose ve arabinopentaose) hidroliz ederek arabiboz şekeri açığa çıkardığı gözlendi ve bu açığa çıkan arabinoz şekeri ince tabaka kromotografisi (TLC) ile tespit edildi. A. kestanbolensis AC26Sarı suşuna ait arabinofuranosidaz enziminin endo arabinanaz aktivitesi substrat olarak Red Debranched Arabinan ( RDA) kullanılarak araştırıldı ve yapılan deneyler sonucunda enzimin endoarabinanaz aktivitesine sahip olmadığı görüldü. Yapılan çalışmalar sonucunda enzimin bir ekzo-arabinofuranosidaz olduğuna karar verildi.