Anoxybacillus gonensis D-glukoz (D-ksiloz) izomeraz geninin klonlanması, izolasyonu ve karakterizasyonu

Abstract

Glukoz izomeraz, büyümek için karbon kaynağı olarak ksilozu kullanabilme yeteneğine sahip ve birçok bakteride bulunan hücre içi bir enzimdir. Glukoz izomeraz, D-ksilozun D-ksiluloza dönüşümünü katalizlediği gibi aynı zamanda D-glukozun D-fruktoza dönüşümünü de katalizlemektedir. Bu ikinci özelliği High Fructose Corn Syrup (HFCS; yüksek içerikli fruktoz şurubu) üretiminde endüstriyel alanda kullanılmaktadır. HFCS büyük oranda meşrubat, fırın, şeker ve konserve gibi sanayi ürünlerinde kuUanılmaktadır. Glukoz izomeraz, hücre içi bir enzim olması ve glukoza olan düşük Km değeri karşılamak için yüksek miktarlarda ihtiyaç duyulması sebebiyle pahalı bir enzim olarak dikkate alınabilir. Termofîlik bir bakteri olan Anoxybacillus gonensis G2T, glukoz izomeraz aktivitesine ve bu aktiviteyi sağlayan enzimin genine sahiptir. Bu çalışma; Anoxybacillus gonensis G2T glukoz izomeraz geninin klonlanması, gen ürününün İzolasyonu ve karakterizasyonunu içermektedir. Çalışmada glukoz izomerazı kodlayan xylA geninin 530 bp lik bir parçası klordandı ve baz dizilimi belirlendi. Maksimum aktivite 85°C'de pH 6,5'da gözlendi. Hücre özütünün 30 dakika, 85°C'de inkübe edilmesi sonucunda, glukoz izomeraz aktivitesi % 50 oranında azaldı. pH 5-9,5 aralığında 4°C'de 300 dakika bekletilen enzimin bu pH değerlerinde kararlılığını koruduğu tespit edildi. Glukoz için olan 15,24 mM Km değeri ile diğer glukoz izomerazlardan daha düşük bir Km değerine sahip olduğu belirlendi. Enzimin 85°C'deki ısıl kararlılığını Co+2nin artırdığı, Mg+2'nin değiştirmediği, Mn+2nin ise azalttığı gözlendi. Glukoz izomeraz aktivitesi için Co+2, Mg+2 ya da Mn+2 bivalent metal iyonlarından en az birini gerekli olduğu bulundu ve en yüksek aktivitenin Co+2 metal katyonu varlığında olduğu belirlendi. Cd+2, Ca+2, Sn+2, Hg+2, Ni+2, Zn+2, Fe+2 veya Cu+2 gibi bivalent metal katyonlan ile gerçekleştirilen denemeler, bu bivalent metal katyonlarının enzim aktivitesini inhibe ettiği gözlendi. Elektroforetik deneyler, Anoxybacillus gonensis G2T Gl'ımn alt birimlerinin moleküler ağırhklarmın 43 kDa civarında olduğunu gösterdi. Elde edilen veriler; Anoxybacillus gonensis G2T Gl'ının ısıl ve pH kararlı bir enzim olduğunu ve pH 6 gibi asidik ortamlarda aktivitesinin yüksek olduğunu göstermektedir. Bu sonuçlar ve diğer biyokimyasal verilerle, Anoxybacillus gonensis G2 Gl'ının önemli bir endüstriyel izomeraz olabiceceği söylenebilir.