Lepista Flaccida (Sowerby:Fr.) Pat. mantarından beta glukozidaz ve endoglukanaz enzimlerinin kısmi olarak saflaştırılması ve karakterizasyonu

Abstract

Bu çalışmada, Trabzon'un Hıdırnebi Yaylası'ndan toplanan Lepista flaccida makromantarından ß-glukozidaz ve endoglukanaz enzimleri kısmen saflaştırıldı ve karakterize edildi. Farklı pH'larda tamponlar kullanılarak hazırlanan ham özütlerde ß-glukozidaz ve endoglukanaz aktiviteleri bakılarak en uygun ekstraksiyon pH'ları belirlendi. Hazırlanan ham özütte ve amonyum sülfat çöktürmesi sonrası elde edilen çözeltide ß-glukozidaz varlığı doğal poliakrilamid jel elektroforezi ve substrat boyaması ile ortaya konuldu. Ham özütte üç bandın varlığı gözlenirken, çöktürme sonrası elde edilen çözeltide bu bantlardan sadece bir tanesinin olduğu gözlendi. Ayrıca L. flaccida mantarından hazırlanan ham özütler gradientli amonyum sülfat çöktürme yöntemi ile çöktürülüp her bir enzim için spesifik aktivitelerin en yüksek olduğu konsantrasyonlar tespit edildi. ß-Glukozidaz için %20, 30 ve 40 ve endoglukanaz için %70-80'lik çöktürmeler sonrası elde edilen çözeltilerde en yüksek spesifik aktivite ve saflaştırma katsayılarına ulaşıldığı tespit edildi. Kısmen saflaştırılan enzimler biyokimyasal olarak karakterize edildi. Her iki enzim için optimum pH değeri 4,0 olarak bulundu. Optimum sıcaklık değeri ise ß-glukozidaz için 60 °C, endoglukanaz için 50 °C olarak bulundu. Enzimlerin pH kararlılıkları incelendiğinde endoglukanazın ß-glukozidaza nazaran daha kararlı olduğu görüldü. Enzimlerin ısıl kararlılık profilleri incelendiğinde ise ß-glukozidazın özellikle düşük sıcaklıklarda 48 saat sonunda kararlılığını endoglukanaza göre daha çok koruduğu görüldü. Yapılan kinetik çalışmalar sonucu ß-glukozidaz için pNPG substratı varlığında Vmaks ve Km değerleri sırası ile 5,78 nmol.dak-1mg-1 protein ve 1,06 mM olarak, endoglukanaz için ise CMS varlığında [S]0,5 veya K0,5 değeri 7,7 mg/mL, Vmaks değeri 25 mikro mol.dak-1mg-1 protein olarak bulundu. Ayrıca bazı metal iyonları ve kimyasal maddelerin her iki enzim aktivitesini de farklı şekillerde etkilediği tespit edildi. In this study, beta-glucosidase and endoglucanase were partially purified and characterized from Lepista flaccida mushroom picked up at Hıdırnebi Plateau in Trabzon, Turkey. The activity of beta-glucosidase and endoglucanase were determined in the crude extracts prepared by using buffers having different pH values and the suitable buffers were chosen for the extraction. The presences of beta-glucosidase in the crude enzyme extract and in the solution obtained after ammonium sulfate precipitation were put forward by native polyacrylamid gel electrophoresis. While three bands were observed in the crude extract a single band was observed after ammonium sulfate precipitation. Besides, the crude extract from L. flaccida mushroom was gradient precipitated by ammonium sulfate and the specific activities of the enzymes calculated. The highest beta-glucosidase and endoglucanase activities were determined at 20, 30, 40% and 70-80% ammonium sulfate concentration, respectively. Partially purified enzymes were biochemically characterized. The optimum pH values for the both enzymes were found to be 4.0. Optimum temperatures for ß-glucosidase and endoglucanase were found to be 60 °C and 50 °C, respectively. When the pH stability of each enzyme was examined, it was seen that endoglucanase was more stabile then ß-glucosidase. When the thermal stability profiles of the enzymes were investigated, it was observed that ß-glucosidase conserved its activity more then endoglucanase at especially low temperatures. Vmax and Km values of ß-glucosidase in presence of pNPG were found to be 5.78 nmol.min-1mg-1 protein and 1.06 mM, respectively. For endoglucanase, [S]0.5 or K0.5 and Vmax in the presence of CMC 7.7 mg/ml and 25 micro mol.min-1.mg-1 protein, respectively. Also, some metal ions and chemicals were effected enzymes activities in different ratio.