Amanita vaginata var. vaginata ve Tricholoma terreum mantarlarındaki esterolitik aktiviteden sorumlu enzimlerin karakterizasyonu

Abstract

Bu çalışmada, Trabzon'un Maçka ilçesi, Lişer yaylasından toplanan Amanita vaginata var. vaginata ve Tricholoma terreum mantar türlerine ait numunelerde esterolitik aktivite gösteren enzimler karakterize edildi. Özütlerdeki esterolitik aktiviteden sorumlu enzimlerin varlığını ortaya koymak için doğal protein elektroforezi yapıldı, her bir numune için aktivite boyamasından sonra ikişer bant ortaya çıktı ve Rf değerleri hesaplandı. Özütlerin p-nitrofenil bütirat (pNPB) substratı varlığında en yüksek aktivite gösterdiği tespit edildi. Her iki mantar numunesi için optimum pH değerinin 8,0, optimum sıcaklığın ise 30?40 °C aralığında olduğu belirlendi. Lineweaver?Burk eğrisinden elde edilen Vmaks ve Km değerleri A. vaginata var. vaginata için sırasıyla 14,20 U/L ve 0,071 mM; T. terreum için ise 34,6 U/L ve 9,6 ? M olarak bulundu. Her iki mantar numunesinden hazırlanan özütlerde esterolitik aktivite gösteren enzimlerin pH kararlılıklarının 3,0?10,0 arasında sabit olduğu gözlendi. A. vaginata var. vaginata numunesi için yapılan ısıl kararlılık denemesinde en yüksek aktivite değerlerine 30 °C'de ulaşıldı. Aktivite genel anlamda 10?40 °C aralığında oldukça yüksek olup, zaman ilerledikçe fazla bir azalma göstermedi. 60?70 °C aralığında ise aktivitenin kaybolduğu gözlendi. T. terreum numunesi için ise 10?40 °C aralığında enzim aktivitesinin korunduğu tespit edildi. 80 °C'de ise aktivitenin kaybolduğu gözlendi. Esterolitik aktivite üzerinde metal iyonların etkisini incelemek için bazı metal iyonlarının klorür tuzları kullanıldı. Ayrıca NaN3, EDTA, PMSF, DTT gibi kimyasalların her bir mantar numunesindeki enzim aktivitesi üzerine etkileri incelendi ve I50 değerleri belirlendi. Bütün bu veriler, her iki mantar numunesinde de esterolitik aktivitenin varlığını göstermektedir. Ayrıca iki mantar için kısa karbon zincirli bir substrat olan pNPB mevcudiyetinde aktivitenin maksimum olması ve uzun karbonlu substratlar varlığında aktivitenin oldukça azalması veya tamamen kaybolması karakterize edilen enzimlerin gerçek esteraz sınıfı enzimler olabileceği sonucunu ortaya koymaktadır. Characterization of the Enzymes Having Esterolytic Activity from Amanita vaginata var. vaginata and Tricholoma terreum MushroomsIn this study, characterization of enzymes having esterolytic activity from the mushroom samples of Amanita vaginata var. vaginata and Tricholoma terreum harvested from the Lişer High Plateau in Maçka (Trabzon) were investigated. To prove the existence of enzymes which are responsible for the esterolytic activities in the extracts, the native protein electrophoresis were applied, two protein bands appeared after the activity staining for each samples and Rf values were calculated. It?s confirmed that extracts showed the greatest activity in the presence of p-nitrophenyl butyrate (pNPB) as a substrat. The pH and temperature optimums of them were found to be 8,0 and 30?40 °C, respectively. Vmax and Km values were calculated from the Lineweaver-Burk curves. For A. vaginata var. vaginata, Vmax and Km values were found as 14,20 U/L and 0,071 mM, respectively. For T. terreum, Vmax and Km values were found as 34,6 U/L and 9,6 ? M, respectively. The pH stability was seen the stationary line between 3,0 to 10,0 for the enzymes having esterolytic activity from the extracts preparing from both mushroom samples. When the temperature stability graphics were investi gated, the highest activity was reached at 30 °C for A. vaginata var. vaginata sample. The enzyme activity was generally considerably high between 10 to 40 °C and its activity didn?t show the great decrease depending on the increasing time. It was seen that its activity lost at 60?70 °C. The enzyme protected its activity from 10 to 40 °C for T.terreum sample. It was seen that the enzyme lost its activity at 80 °C. Chloride salts of some metal ions were used for the investigation of effects of metal ions on the esterolytic activity. Additionally, the effects of various chemicals like EDTA, NaN3, DTT, and PMSF on the enzyme activities of both mushroom samples were tested and I50 values were found. These results showed that the existence of esterolytic activity for both mushroom samples. Additionally, being the activities are maximum in the presence of pNPB, a substrate having the short carbon chain and considerably decrease in the activities in the presence of the long carbon chain substrates for these mushrooms can be displayed that the enzymes characterized can be belonged to the class of true esterase.