Süs bitkilerinden elde edilen flavonoid 3'-hidroksilaz (F3'H) ve flavonoid 3'5'-hidroksilaz (F3'5'H) enzimlerinin klonlanmaları, karakterizasyonları ve substrat spesifitelerinin çalışılması

Abstract

Bu çalışmanın öncelikli amacı, çeşitli süs bitkilerinden flavonoid 3'-hidroksilaz (F3'H) ve flavonoid 3'5'-hidroksilaz (F3'5'H) enzimlerini izole etmek ve onları, pYes2.1 vektörü yardımıyla tamamlayıcı DNA (cDNA)'larını oluşturmak ve onları maya içinde hetorolojik olarak ifade etmekti. Çeşitli süs bitki kültürlerinin yaprak kısmındaki mRNA'lar, µMACS mRNA izolasyon kiti kullanılarak izole edilmişlerdir. Ters transkripsiyon, SuperScript II ters transkriptaz ve oligo(-dT) öncü primer kullanılarak gerçekleştirildi. RT-PCR için, primerler bitkilerin mevcut olan F3'H gen dizilerinden, henüz tercümeleri yapılmamış 5' ve 3' bölgeleri için satın alındı. Çeşitli F3 'H genler, birçok primerler kullanılarak test edildi ve çoğaltma için ileri ve ters olmak üzere uygun diziler seçildi. Çoğaltma üretici tarafından belirtilen uygun koşullarda, Taq/Pwo-polimeraz kullanılarak yapıldı. E nzim ifadeleri heterolojik olarak gerçekleştirilen F3'H ve F3'5'H enzimlerinin naringenin (flavonon), kaemferol (flavonol), dihidrokaemferol (dihidroflavonol) ve apigenin (flavon) olmak üzere 4 farklı flavonoid türü ve bir adet fizyolojik önem taşıyan isolikuiritigenin (ISL) adlı kalkon ile reaksiyona sokarak substrat sipesifiteleri belirlendi. Ayrıca, bu substratların çeşitli bitkilerden klonlanan F3'H ve F3'5'H enzimleri için optimum pH'ları bulundu. Bu optimım pH'ların incelenmesiyle apigeninin diğer substratlara göre daha bazik ortamı sevdiği bulundu. Enzimlerin substrat ilgileri bulunduktan sonra, gen dizi karşılaştırmaları gerçekleştirildi. Bilindiği gibi aktif bölgede bulunan sadece 1 amino asit değişikliği bile enzimin aktivitesini değiştirebilmektedir. Gen dizi karşılaştırılmasıyla bulunan benzer ve farklılıklar belirlenerek, aktivitenin gen dizisinin aktif bölgesinde hangi amino asitten kaynaklandığı bulundu. Ger. Hyb. (8) enzimin apigeninle reaksiyon vermemesinin ve bazı enzimlerin ISL ile reaksiyon vermelerinin nedenleri gen dizi karşılaştırılmasıyla bulundu. The primary aim of this work is to isolate flavonoid 3?-hydroxylase (F3?H) and flavonoid 3?5?-hydroxylase (F3?5?H) and to compose cDNA of them with the aid of pYes2.1 vector and ultimately to express them in yeast heterogeneously. The mRNAs which are found at the leaf part of cultures from various ornemantal plants were isolated by means of ?MACS mRNA kit. Inverse transcription was actualized using Supersript II inverse transcriptase and oligo(-dT) primer. Primers that are present in plants from F3?H gene sequences for 5? and 3? zones in RT-PCR were composed. Distinct F3?H genes were tested using numbers of primers and convenient sequences as a reverse and inverse, selected for amplification. Amplification was carried out using Taq/Pwopolimerase under right convenient conditions that were described by producer firm. These enzymes which were expressed heterogeously were tested with four different flavonoids pertaining to each various class as naringenin (flavonone), kaempferol (flavonol), dihydrokaempferol (dihydroflavonol), apigenin (flavone) and physiological chalcone named isoliquiritigenin and substrate specifities of them were found. Subsequently, optimum pHs for these enzmes with same substrates were determined, and substrates specifities were determined. According to outcomes of opt. pH determinations, It was defined that apigenin is basic-lover substrate. After having reached substrate affinities, gene sequences of enzymes were compared with each others. As it is known, one amino acid can bring out changes in enzyme activity. By comparing gene sequences, similarities and differences were determined and the amino acid responsible for enzyme activity in gene sequence has been found. Reason of inactivity of Ger. hyb. (8) enzyme was determined with comparing gene sequences. It was also determined th reason of why the some enzymes that reacted with ISL with same tecnique.